(教学资料图片）
弓形虫自首次发现迄今已有年的历史,人们对其形态结构、生活史和宿主的广泛性等认识逐步加深,对弓形虫的致病性、诊断技术、药物和疫苗的研发持续推进。近年来,在弓形虫的基因结构变异、与宿主细胞的相互作用机制、基因型相关的致病与毒力因子和免疫调控效应分子的研究等方面均获得了重要进展。作为一种顶复门中的重要寄生原虫,弓形虫已经成为研究寄生现象、细胞间相互作用、人体其他重要细胞内寄生虫(如疟原虫,隐孢子虫等)致病机制和药物筛选的模式生物。我国弓形虫和弓形虫病研究虽起步较晚,自年于恩庶在福建省动物体内分离到虫体以来,由于该寄生虫对人类健康及畜牧业生产危害较大,因此兽医学界与医学界对其研究热情不减。随着我国传统的几种重大寄生虫病(如内脏利什曼病、丝虫病、疟疾、血吸虫病和钩虫病)先后被消除或得到有效控制,食源性疾病的防治研究受到高度重视。由于弓形虫具有复杂的生活史、独特的宿主细胞互作模式以及相对易于培养和基因操作等特点,近年来对于弓形虫与弓形虫病的研究吸引了众多学者,尤其是年轻学者,并逐步成为我国人体寄生虫学与动物寄生虫学的研究热点。本文拟从弓形虫感染流行现状、基因分型、诊断、治疗和疫苗研究等方面加以综述,旨在为我国弓形虫病研究提供参考。1流行病学弓形虫的动物宿主种类十分广泛,几乎所有的海洋和陆生温血动物均可被寄生。猫科动物是其终宿主或中间宿主。家猫(主要是流浪猫)排出的卵囊是人和动物感染弓形虫的主要来源之一,且我国猫弓形虫感染率较高,约为24.5%。人类弓形虫感染的途径主要有3种:(1)食入被猫粪中弓形虫卵囊污染的食物或饮水;(2)摄入含有包囊的未熟肉类或肉制品;(3)虫体经胎盘的垂直传播。其他尚有经输血、器官移植和生乳品等感染的可能。弓形虫感染呈世界性分布。据估计全球约1/3的人口呈弓形虫血清抗体阳性,但感染率具有明显的地域差异。欧美人群弓形虫抗体阳性率为25%～50%,20世纪60年代调查发现少数发达国家弓形虫抗体阳性率超过80%。近年由于肉制品上市前的预处理,欧洲弓形虫感染率呈明显下降趋势,但仍在40%左右。巴西孕妇弓形虫血清学阳性率至今仍高达50%～80%。我国在全国范围内进行过两次较大规模的血清流行病学调查。–年采用间接血凝试验(IHA)调查了19个省(直辖市、自治区)个县的名居民,结果显示弓形虫抗体阳性率为0.33%～11.79%(平均5.16%);–年采用酶联免疫吸附试验(ELISA)在15个省(直辖市、自治区)检测人,抗体阳性率为0.79%～16.80%(平均7.88%)。最新的一项分析显示,我国普通人群弓形虫抗体阳性率为8.20%,孕妇为8.60%,两者基本持平,但癌症患者抗体阳性率(16.8%)高于普通人群,在某些类型的癌症患者中尤为突出。这种现象仅用人体免疫力下降似乎难以解释,因为弓形虫病是一种食源性机会致病性寄生虫病,人群对弓形虫普遍易感,感染高风险(表现为血清抗体阳性)主要与不洁和不良的饮食习惯以及宠物饲养等有关。肿瘤患者高弓形虫抗体阳性率的原因有待深入探究。肉用家畜家禽的感染造成养殖业经济损失,也成为人体感染的潜在风险。调查发现,肉用动物包括绵羊、鸡和猪平均弓形虫抗体阳性率分别为13.87%、19.00%和29.45%。同为食草动物,山羊血清弓形虫抗体阳性率(17.04%)高于牛(平均7.54%),其因不明,有学者提出可能与羊经胎盘垂直传播的概率较高有关。最近对河南省17个市的头奶牛采用改良凝集实验(MAT)调查发现,中原地区奶牛血清弓形虫抗体阳性率仅为1.93%。值得指出的是,各地调查所采用的检测方法不一致,包括IHA、ELISA、MAT和胶乳凝集试验(LAT)等,所用抗原亦未标准化,其特异性和敏感性不同,可能会导致结果差异。合理设计、对同一地区同类人群采用统一检测技术、适时启动新的动态调查,对于准确掌握我国弓形虫感染的流行情况、制定合理的弓形虫病防控策略具有重要意义。2弓形虫的基因分型与命名弓形虫具有丰富的遗传变异(基因型)。数学模拟分析推测,弓形虫基因结构的差异是由于一万多年来人类的耕作、迁移和贸易,选择性地促进了弓形虫在家猫-鼠的寄生关系和各地域优势基因型的演化。基因分型方法较多,包括多位点酶电泳(MLEE)、可移动遗传元件聚合酶链反应(MGE-PCR)、随机扩增多态性DNA聚合酶链反应(RAPD-PCR)、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、微卫星(MS)标记、多位点DNA测序(MLST);此外,还有血清学分型等。目前以PCR-RFLP方法最为常用,该方法依赖于内切酶来识别核苷酸序列中的单核苷酸多态性(SNP)。虽然弓形虫基因组中SNP突变率较低(10-9～10-10),但由于该方法操作简便、经济,在各实验室得到广泛应用,我国也大多采用此法进行分型研究。早年,Sibley等曾采用3个PCR-RFLP标记物对来自全球的28个弓形虫虫株基因多样性与弓形虫小鼠毒力之间的关系进行了研究,结果发现毒力株均为同一基因型。随后Howe等进一步将PCR-RFLP标记物扩展到6个,并对来自北美和欧洲的个弓形虫虫株进行了分型,发现这些虫株主要属于3个基因型,亦即经典的I型、II型和III型。与北美和欧洲的弓形虫基因型不同,当运用10个PCR-RFLP基因标记物对来自巴西的个虫株进行分型时,发现了48个基因型,证明了南美洲弓形虫具有更加丰富的遗传多样性。由于各实验室采用不同方法对不同地区或宿主来源的虫株进行分型研究,因此对弓形虫的基因分型命名尚需统一。传统的基因型命名是基于PCR-RFLP的前述3个经典基因型,亦称原型(Archetype)或克隆系(Clonallineage),所有其他型别均被称之为非典型基因型(Atypicalgenotype)。弓形虫PCR-RFLP数据库(ToxoDB#)基因型命名是基于10/11个PCR-RFLP标记物(SAG1、5-3SAG2、alt.SAG2、SAG3、BTUB、GRA6、L、c22-8、c29-2、PK1a和Apico)的分型结果编码,迄今已报告了个基因型。上述标记物可区分原型和II型变异型(TypeIIvariant)。II型的原型在Apico位点为经典2型等位基因(如PTG株);而II型的变异型在Apico位点为经典1型等位基因(如PRU株)。单体型(haplogroup)命名系统是基于5个内含子(UPRT、MIC、BTUB、HP和EF)的DNA测序结果,目前命名的有16个单体型。欧洲和北美人体感染多为II型弓形虫。我国弓形虫的基因结构研究起步相对较晚。年,Dubey等首先对采自广州的34只流浪猫的心肌、舌肌和脑组织进行弓形虫虫体分离,结果获得17个虫株;采用PCR-RFLP分型鉴定出2个基因型,其中15株均为ToxoDB#9。随后国内多个课题组采集了来自不同地区的猫、犬、家畜(羊、猪或市售猪肉、牛、牦牛、驴)、家禽(鸡、鹅)、野生动物(野生水禽、梅花鹿、麻雀、野鸡、高原鼠兔、田鼠、北极狐、大熊猫、蝙蝠、野猪等)和人体的组织标本进行弓形虫虫株分离,或获取DNA样本进行基因分型。迄今共对份样本(包括个虫株和份DNA样本)进行PCR-RFLP分型,鉴定出了12个基因型;其中ToxoDB#9型株(65.2%)、ToxoDB#10型(即I型)52株(17.0%)、ToxoDB#1型(即II型)和ToxoDB#3型(即II型变异型)共18株(5.9%)、ToxoDB#2型(即III型)3株(1.0%)、ToxoDB#型8株(2.6%),其他型别还包括ToxoDB#17、ToxoDB#18、ToxoDB#20、ToxoDB#、ToxoDB#和ToxoDB#等。由此可见,ToxoDB#9为我国的优势弓形虫基因型,因而被命名为Chinese1型。我国弓形虫基因型分布模式与欧洲和北美类似,即少数基因型占据流行株的绝大多数。Su等基于基因组SNP进化树分析,将全球的弓形虫株分为6个分支(CladeA～F)和16个单倍体型(Type1～16)。中国的优势基因型Chinese1(代表虫株TgCtPRC04)属于type13单倍体型,该型和II型属于同一分化支(CladeD)。此外,我国弓形虫Chinese1基因型存在强毒株(TgCtwh3)和弱毒株(TgCtwh6),强毒株个速殖子感染昆明小鼠30d内死亡率达92.9%;而弱毒株感染同期小鼠死亡率为45%,且可在脑内成囊。鉴于同一基因型的不同毒力,提示上述10个遗传标记物的PCR-RFLP分型并不能区分我国Chinese1型虫株的毒力特征。为进一步揭示Chinese1基因型弓形虫的毒力相关分子,宜采取组学技术及基因编辑技术进行深入研究。有趣的是,无论是欧洲和北美的弓形虫原型虫株还是南美的非原型虫株,ROP16被认为是一种重要的毒力相关分子。但是我国的Chinese1型虫株兼具ROP16I/III和GRA15II两个调控宿主免疫应答的关键效应分子,并且敲除ROP16的TgCtwh3株并未见到毒力减弱。这些结果提示我国的Chinese1优势基因型弓形虫虫株具有独特的毒力特征和致病机制。3致病机制弓形虫的致病与虫株的基因型和毒力密切相关。据报道,欧洲(尤其在法国)的人体弓形虫感染主要是由II型虫株引起,因此从先天性弓形虫病病理组织分离的虫株亦多属II型;其次是I型,III型主要见于动物。但在南美洲,先天性感染大多数为非原型虫株。如Pardini等从急性弓形虫感染的产妇脐带血中分离到6个虫株均为非原型基因型,虫株毒力较强;与欧洲相比,南美洲患者临床上眼弓形虫病较多见。已知弓形虫感染导致的病理改变主要是虫体增殖引起的组织炎性及坏死,其次为某些效应分子诱导的细胞凋亡。免疫机能正常者弓形虫感染通常呈自限性,或无明显临床表现。但近年不断增多的报道显示,这种隐性感染与某些神经精神疾病有关。一般而言弓形虫致病力的强弱取决于虫株毒力、增殖速率以及宿主种类。然而由于弓形虫不能在宿主细胞外分裂增殖,因此目前对于毒力的测定均是体外检测对宿主细胞的毒性,或是对易感动物(如小鼠)的致病/致死性,或是观察是否可成囊等。宿主在感染早期的固有免疫屏障对感染后的结局至关重要。近年来,对弓形虫急性毒力相关分子的研究取得重要进展。已知ROP18-ROP5-ROP17的结合成为关键的急性毒力因子,在小鼠可直接磷酸化免疫相关GTP酶(IRGs),使后者不能结合于纳虫泡膜(PVM),从而阻断了NK、CD4+和CD8+细胞分泌的IFN-γ介导的宿主免疫力。ROP18可抑制ATF6β,抑制树突状细胞抗原递呈。研究发现ROP18可以磷酸化一种神经系统高表达的内质网应激蛋白RTN1-C,导致神经元凋亡,成为弓形虫嗜神经性和脑炎的致病机制之一。弓形虫效应分子可“劫持”宿主免疫相关基因的表达,其多态性与致病和感染结局密切相关。例如I型(如RH株)虫体棒状体蛋白ROP16I/III(而非II型虫株如PRU或Me49的ROP16II)可直接激活Stat3/6,诱导宿主巨噬细胞向M2极化,抑制Th1应答;同时I型虫株的致密颗粒蛋白GRA15I不具有在感染早期诱导IL-12表达的能力,IFN-γ和IL-12抑制导致了虫体在巨噬细胞内大量增殖,感染动物在急性期死亡。而在II型虫株(如PRU或Me49)分泌的GRA15II则在感染后迅速激活Stat1和NF-κB,驱动巨噬细胞向M1极化,后者高表达诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和产生一氧化氮(NO)以及促炎细胞因子,结果在急性期可清除虫体,或促使虫体在脑和肌肉中成囊,建立慢性感染。值得指出的是,以上研究结果均是在小鼠细胞或动物模型中获得的,有些并非适用于人体。例如,IRGs在小鼠抗弓形虫感染中发挥重要作用,但人类细胞中缺乏IRGs。近期研究发现,与小鼠的iNOS抗弓形虫作用相反,在人类细胞iNOS反过来可以促进虫体增殖。将人原代单核细胞与人原代肝细胞共培养后,GRA15诱导的免疫应答反而抑制了IFN-γ的抗虫作用;在IFN-γ存在时,GAR15和NLRP3炎性小体刺激人单核巨噬细胞表达IL-1β,后者可强力诱导肝细胞表达iNOS和NO;但令人意外的是,iNOS显著降低了吲哚胺2,3-加双氧酶酶(IDO1)水平。IDO1是一种色氨酸代谢酶,是IFN-γ诱导的人体抗弓形虫强力免疫应答的关键分子;IDO1低表达导致了色氨酸堆积,促进了胞内弓形虫繁殖。以上结果提示,弓形虫在与宿主细胞共进化过程中,获得了抵抗GRA15诱导的IFN-γ介导的免疫杀虫作用。已知先天性弓形虫病是一种严重危害优生优育的重要寄生虫病。孕妇在孕期(尤其是孕早期)急性感染弓形虫后,虫体增殖可破坏胎盘屏障,直接侵犯胎儿,导致严重的不良妊娠结局。然而在流行病学调查中发现,有些流产组织,甚至是母体血清IgG抗体阳性的胎盘病理组织也难以分离出弓形虫,甚至弓形虫DNA检测也呈阴性结果。这一现象提示,某些弓形虫感染相关的不良妊娠可能并非是虫体直接入侵引起的,而与弓形虫感染诱导的母胎界面的免疫耐受失衡有关。例如,弓形虫GRA15II可体外诱导绒毛膜细胞发生内质网应激介导的凋亡;Chinese1弓形虫Wh3株可经氧化应激和线粒体损伤导致滋养细胞凋亡;Wh6弱毒株也可引起大鼠孕期免疫功能紊乱,导致不良妊娠结局;PRU株感染小鼠诱导蜕膜巨噬细胞向M1极化与不良妊娠密切有关;敲除ROP16I/III的Chinese1虫株体外引起更为严重的滋养细胞凋亡,感染孕鼠出现更为严重的不良妊娠结局。上述胎盘和胎儿损伤与弓形虫诱导的母体IL-17A、IFN-γ和IL-12高表达,IL-4、IL-10和TGF-β等Th2细胞因子分泌减少,以及Tregs损伤有关。由于上述研究仍采用孕小鼠模型,人体弓形虫感染所致的不良妊娠是否与免疫失衡有关尚待深入研究。4诊断弓形虫感染的病原学检查确诊较为困难。病原检测主要有直接镜检、滋养体分离培养和包囊检查等,但多用于动物感染诊断或虫体分离,以及特殊情况下人体病理组织检查。目前,弓形虫核酸、血清循环抗原和特异性抗体检测在临床上较为常用。核酸检测方法包括常规PCR、巢式PCR、RT-PCR;常用的DNA靶标包括B1基因或bp的重复序列、内部转录间隔序列(ITS-1)和18SrDNA序列。此外,环介导等温扩增法(LAMP)也可用于人类和动物样本以及水样本中弓形虫检测。该方法只要求水浴或加热器,在缺乏昂贵仪器时不失为一种选择。理论上,核酸检测阳性只见于虫血症、病理组织或体液中弓形虫的存在,因此不适用于人体慢性隐性弓形虫感染的诊断。我国应用最广的弓形虫抗体检测方法是ELISA和凝集试验。前者敏感性优于后者,但凝集试验由于检测过程中不需要第二抗体因而更适合于现场流行病学调查。常用的凝集试验包括MAT、IHA和LAT。间接ELISA最常用,诊断抗原包括速殖子可溶性提取物、排泄分泌抗原及各种重组抗原;检测靶标包括抗体(IgG及其亲和力、IgM、IgA)和循环抗原。我国尽管基于上述抗原或抗体设计了各种检测试剂,但市售弓形虫感染诊断试剂盒在特异性和敏感性方面似逊于国外同类产品,有些临床应用的可靠性尚待客观评估。为了规范诊疗标准,原国家卫生和计划生育委员会于年发布了首个弓形虫病的诊断标准(WS/T-),为弓形虫病诊断提供了技术规范。5治疗弓形虫的药物治疗从20世纪60年代至今未获得突破性进展。自年Sabin和Warren报道磺胺嘧啶的抗弓形虫作用,及年Eyles和Coleman发现乙胺嘧啶的增效作用以来,这两个药物的联合使用一直是弓形虫病的标准治疗方案。它们均为弓形虫叶酸的拮抗剂,对增殖期弓形虫有抑制作用,但其治疗存在疗程长、不良反应多等缺点。螺旋霉素由于其毒性低且不能通过胎盘,已广泛应用于治疗妊娠期获得性急性弓形虫感染,可减少弓形虫的母婴传播。此外克林霉素、阿托伐醌、克拉霉素和阿奇霉素等也具有抗弓形虫作用,但疗效仍不及乙胺嘧啶-磺胺嘧啶联合疗法,可用于对磺胺类药物过敏患者的替代治疗。值得注意的是,有报道乙胺嘧啶用于免疫缺陷患者和阻断先天性传播的治疗效果不佳,原因可能是患者吸收不良或对药物过敏,也可能是由于弓形虫基因突变导致对药物敏感性下降。例如,Silva等检测了自巴西人体分离的非原型基因型5个虫株对磺胺嘧啶的敏感性出现较大差异,但未见到叶酸代谢酶基因的突变与药敏有关,提示其他基因变异可能导致虫体对该药产生抗性。我国弓形虫Chinese1虫株对传统磺胺类药物是否存在抗性尚未见报道。正是由于以上治疗方案的诸多缺陷,我国学者一直致力于挖掘中药宝库以期开发高效低毒的抗弓形虫药物。现已发现青蒿素及其衍生物、大蒜素、扁桃酸、金丝桃素、白藜芦醇等对弓形虫的增殖均有直接或间接抑制作用,但其具体药理作用及临床效果评估还有待进一步深入研究。6疫苗在当前缺乏理想治疗药物的情况下,弓形虫病疫苗的研发尤为迫切。对家猫的预防接种能减少卵囊排出;对家养动物的预防接种能提高牲畜产量,也能减少肉制品中包囊数量而降低人类感染的风险。然而遗憾的是,目前除了唯一商业兽用减毒活疫苗“Toxovax”用于预防绵羊和山羊感染外,尚无其他实用的弓形虫病疫苗问世“Toxovax”疫苗虫株最初从羊体内分离,其速殖子在小鼠体内经过长期传代后,丧失了对羊的致病力和猫肠道内卵囊形成的能力。用该疫苗免疫绵羊和山羊后能明显减少体内虫荷、减轻肌肉和中枢神经系统病变,但未完全阻止组织包囊形成;作为一种非持续性感染的虫株,具有良好的安全记录。年,Fox等又研发出一株尿嘧啶营养缺陷型非复制型II型减毒活疫苗,接种小鼠后无毒力、在体内不形成包囊,故不会引起慢性感染,且可诱导小鼠产生CD8+介导的抗I型强毒或II型弱毒虫株急性感染的完全保护力,还可以预防II型虫株包囊形成。该研究是继“Toxovax”后又一个有希望的基因改造的活虫疫苗。此外,重组或天然分子疫苗的研究几乎包含除了包囊以外的弓形虫生活史各期蛋白抗原,但仍未能筛选出理想的候选分子疫苗。我国自20世纪90年代以来主要集中在DNA疫苗、重组蛋白疫苗及减毒活疫苗的研究。重组多肽疫苗和DNA疫苗均源于速殖子表面抗原(SAG)、细胞器分泌抗原(如致密颗粒蛋白GRA、棒状体蛋白ROP、微线体蛋白MIC)以及非表面或分泌蛋白抗原(如热休克蛋白70、肌动蛋白等)。这些疫苗虽然能在一定程度上诱导Th1应答、提高小鼠存活率或延长存活时间、减少包囊负荷,但到目前为止尚无有效的DNA疫苗或亚单位疫苗能够用于临床。随着CRISPR/Cas9基因编辑技术在弓形虫领域内广泛应用,越来越多的基因缺失虫株被构建,将成为弓形虫减毒活疫苗可能的候选虫株。（人与宠物猫资料图片）7结语弓形虫病作为一种重要的食源性寄生虫病,随着我国社会经济的发展、食品的富足、民俗多元化和饮食方式的多样化、宠物猫的饲养,加之国际互联互通和人口的频繁流动,我国人畜弓形虫感染风险将面临严峻挑战。因此,树立“健康促进-疾病预防-疾病治疗”的大健康观、严格家养动物的集中科学养殖、强化宠物的管理、加强食品卫生检验和上市前的无害化加工处理、广泛开展弓形虫病预防的科普教育,可有效降低人畜食源性弓形虫感染率。采用新理论、新技术、新策略,深入开展我国人兽间流行的弓形虫生物学和临床研究,对于弓形虫病的预防、控制和治疗具有重要意义。（文章来源：:31;1中国血吸虫病防治杂志沈继龙余莉参考文献略）预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇