论著丨血浆外泌体miRmiR

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陈依梦,王振国,何小舟,等.血浆外泌体miR-、miR-21和miR-对肾移植术后并发慢性移植肾肾病的诊断价值［J/CD］.中华移植杂志：电子版,,14(4):-.

目的检测肾移植受者术后血浆外泌体miR-21、miR-和miR-表达变化，分析外泌体miR-21、miR-和miR-单独及联合对肾移植术后并发慢性移植肾肾病（CAN）的诊断价值。方法回顾性分析年1月至年1月医院泌尿外科实施的同种异体肾移植受者临床资料，最终纳入34例受者，根据肾移植术后是否发生CAN将其分为CAN组及对照组。采用凝胶排阻色谱法提取血浆外泌体，采用NanosightNS分析外泌体粒径，采用蛋白质印迹法（WB）分析外泌体表面标志物（CD63和Alix）表达情况。采用卡方检验比较CAN组和对照组受者性别比例。采用成组t检验比较两组受者移植前年龄、末次血清肌酐、血清尿素氮和估算肾小球滤过率（eGFR）。采用受试者工作特征（ROC）曲线评价血浆外泌体miR-、miR-21和miR-对肾移植术后并发CAN的诊断效能。P0.05为差异有统计学意义。结果CAN组（n=18例）和对照组（n=16例）受者性别以及移植前年龄、末次血清肌酐、血清尿素氮和eGFR差异均无统计学意义（χ2=0.04、t=0.86、-1.84、-1.83和0.85，P均＞0.05）。透射电镜、NanosightNS及WB检测结果均提示提取样本为血浆外泌体。CAN组与对照组血浆外泌体miR-、miR-21和miR-相对表达量差异均有统计学意义（t=4.13、3.38和2.33，P均＜0.05）。miR-预测肾移植术后并发CAN的ROC曲线下面积为0.（95%CI：0.~0.，P＜0.05），当截断值=1.时，敏感度为66.7%，特异度为93.8%。miR-21预测肾移植术后并发CAN的ROC曲线下面积为0.（95%CI：0.~0.，P＜0.05），当截断值=1.时，敏感度为55.6%，特异度为93.8%。miR-预测肾移植术后并发CAN的ROC曲线下面积为0.（95%CI：0.~0.，P＜0.05），当截断值=0.，敏感度为66.7%，特异度为75.0%。随后，构建基于miR-、miR-21和miR-3个指标的联合诊断模型，回归方程z=5.×［miR-］+5.×［miR-21］+0.×［miR-］-13.，联合预测概率值p=ez/(1+ez)。miR-、miR-21和miR-联合预测肾移植术后并发CAN的ROC曲线下面积为0.（95%CI：0.~1.，P＜0.05），当截断值=0.，敏感度为83.33%，特异度为93.75%。当联合预测值为0.时，CAN组有83.3%（15/18）的个体被联合预测模型诊断出阳性结果，而对照组有93.8%（15/16）的个体被联合预测模型诊断出阴性结果，表明该联合预测模型有较好的诊断价值。结论miR-、miR-21和miR-组成的miRNA阵列可能可以用于早期诊断肾移植术后并发CAN。

慢性移植肾肾病；外泌体；微小RNA；联合诊断；肾移植

肾移植已成为治疗终末期肾病最有效的方式，但存在排斥反应、免疫抑制剂不良反应及供肾来源不足等问题。慢性移植肾肾病（chronicallograftnephropathy，CAN）是导致肾移植术后移植物失功的主要原因。准确监测和评估移植肾功能对肾移植受者至关重要，目前评估移植肾损伤发生和进展的指标和方法主要包括血清尿素氮、血清肌酐、估算肾小球滤过率（estimatedglomerularfiltrationrate，eGFR）、尿蛋白及移植肾穿刺活检。但这些方法或存在特异度/敏感度低，或具有侵入性等缺点。近年来研究发现，外泌体和细胞外囊泡可以包裹和携带非编码微小RNA（microRNA，miRNA）并稳定存在于循环系统，这使得外泌体miRNA具备了成为无创、可靠生物标志物的条件。本团队前期利用miRNA芯片和实时定量PCR研究发现了一系列与大鼠肾脏缺血、缺氧密切相关的miRNA。在此基础上，结合miRNA在肾脏和外周血表达水平变化的相关文献报道，本文旨在探讨miR-、miR-21和miR-对肾移植术后并发CAN的诊断价值，现报道如下。

1资料与方法

1.1研究对象及分组

年1月至年1月医院泌尿外科共实施73例同种异体肾移植。纳入标准：（1）首次肾移植且术后随访时间＞3个月；（2）年龄＞18岁；（3）签署知情同意书。排除标准：（1）临床表现和移植肾穿刺病理结果符合急性排斥反应；（2）肾移植术后3个月内更换免疫抑制方案；（3）尿路梗阻和肾动脉狭窄等所致移植肾功能损害；（4）HIV阳性；（5）身体其他部位发生恶性肿瘤；（6）发生严重感染性及免疫性疾病；（7）存在严重心脑血管疾病及其他重要器官功能障碍。最终纳入34例肾移植受者，供肾均来源于脑死亡器官捐献。根据移植术后是否发生CAN，将其分为CAN组和对照组。肾移植术后CAN确诊根据临床和病理相结合的标准进行诊断：（1）临床标准：肾移植术后3个月后出现肾功能进行性减退［eGFR60mL·min-1·（1.73m2）-1］，尿蛋白阳性，血清肌酐及尿素氮水平升高；（2）病理标准：移植肾穿刺活检证实发生CAN。医院伦理委员会审核通过。

1.2研究对象及分组

肾移植术后3个月内每周随访1次，每次随访均留取血样，入组者每次随访均于清晨空腹抽取静脉血4mL，2h内离心、分离上层血浆后，分装储存在1.5mL无菌EP管中，-80℃保存备用。本研究分析的血浆样本为两组受者组移植3个月后首次随访复诊时抽取的单次血样。

采用凝胶排阻色谱法提取血浆外泌体，提取方法参考试剂盒说明书（试剂盒购自英国CellGuidanceSystems公司）。将分离得到的外泌体样品小心滴加于电镜专用铜网上，沉淀1min，用滤纸吸去铜网及镊子交界处边缘浮液。吸取醋酸双氧铀滴加于铜网上，沉淀1min，室温干燥数分钟后，将样品置于80~kV的透射电镜下成像。外泌体粒径分析采用NanosightNS纳米颗粒跟踪分析（ZetaView，德国ParticleMetrix公司）。采用蛋白质印迹法（westernblot，WB）分析外泌体表面标志物（CD63和Alix）表达情况：外泌体样本中加入细胞裂解液，提取外泌体蛋白质，采用BCA法测定蛋白浓度，CD63单克隆抗体（兔抗人）购自美国Proteintech公司（1∶稀释），Alix单克隆抗体（鼠抗人）购自美国CellSignalingTechnology公司（1∶稀释），辣根过氧化物酶标记的羊抗兔和羊抗鼠二抗均购自杭州联科生物有限公司（1∶0稀释）。电镜下观察到清晰茶托样双层膜结构（外泌体典型结构），粒径检测直径约nm，WB检测提示CD63和Alix均阳性，即可判断所获样品为外泌体。

1.3miRNA实时荧光定量PCR检测

采用TrizolLS试剂（美国赛默飞世尔科技有限公司）提取血浆外泌体miRNA，采用miRNA特异性逆转录引物（上海冠泰生物科技有限公司）将miRNA逆转录成cDNA（逆转录试剂盒购自日本Takara公司）。采用ABI荧光定量PCR仪（美国AppliedBiosystems公司）进行目的序列扩增和熔解曲线分析（荧光定量PCR引物购自上海冠泰生物科技有限公司），目的序列引物见表1。血浆外泌体miRNA采用miR-16作为内参，采用ΔΔCt法计算miRNA表达差异。

1.4统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差表示。采用成组t检验比较CAN组和对照组受者移植前年龄、末次血清肌酐、血清尿素氮和eGFR，以及两组受者血浆miR-、miR-21和miR-相对表达量。采用受试者工作特征（receiveroperatingcharacteristic，ROC）曲线评价血浆外泌体miR-、miR-21和miR-对肾移植术后并发CAN的诊断效能。计数资料以百分数表示，采用卡方检验比较两组受者性别比例。P0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1CAN组与对照组一般资料比较

34例受者中18例术后发生CAN（CAN组），平均年龄（40±10）岁（26~53岁），其中男性11例，女性7例，移植前末次血清肌酐、血清尿素氮和eGFR分别为（±）μmol/L、（21±7）mmol/L和（5.4±1.5）mL·min-1·（1.73m2）-1；术后3个月后首次复诊时血清肌酐、血清尿素氮和eGFR分为（±）μmol/L、（11±6）mmol/L和（46±12）mL·min-1·（1.73m2）-1。对照组16例受者中男性10例，女性6例，平均年龄（40±10）岁（27~60岁），移植前末次血清肌酐、血清尿素氮和eGFR分别为（±）μmol/L、（17±5）mmol/L和（6.1±2.7）mL·min-1·（1.73m2）-1；术后3个月后血清肌酐、血清尿素氮和eGFR分别为（92±16）μmol/L、（6±1）mmol/L和（76±9）mL·min-1·（1.73m2）-1。两组受者性别以及移植前年龄、末次血清肌酐、血清尿素氮和eGFR差异均无统计学意义（χ2=0.04、t=0.86、-1.84、-1.83和0.85，P均＞0.05）。

2.2血浆外泌体鉴定结果

透射电镜下观察染色后的外泌体样品，视野内可见直径~nm的圆形颗粒，具有清晰茶托样双层膜结构（见图1a）。NanosightNS检测结果示样品中外泌体分散均匀，主要分布于直径nm处，呈单峰正态分布曲线。WB检测结果示CD63和Alix在样本中富集，且呈浓度依赖性（见图1b）。

2.3CAN组和对照组受者血浆外泌体miR-、miR-21和miR-表达情况

CAN组受者血浆外泌体miR-、miR-21和miR-相对表达量分别为（1.47±0.08）、（1.32±0.08）和（2.77±0.66），对照组分别为（1.00±0.08）、（1.00±0.05）和（1.00±0.31），差异均有统计学意义（t=4.13、3.38和2.33，P均＜0.05），详见图2。

2.4血浆外泌体miR-、miR-21和miR-对肾移植术后并发CAN的诊断价值

miR-预测肾移植术后并发CAN的ROC曲线下面积为0.（95%CI：0.~0.，P＜0.05），当截断值=1.时，敏感度为66.7%，特异度为93.8%。miR-21预测肾移植术后并发CAN的ROC曲线下面积为0.（95%CI：0.~0.，P＜0.05），当截断值=1.时，敏感度为55.6%，特异度为93.8%。miR-预测肾移植术后并发CAN的ROC曲线下面积为0.（95%CI：0.~0.，P＜0.05），当截断值=0.，敏感度为66.7%，特异度为75.0%。随后，构建基于miR-、miR-21和miR-3个指标的联合诊断模型，回归方程z=5.×［miR-］+5.×［miR-21］+0.×［miR-］-13.，联合预测概率值p=ez/(1+ez)。miR-、miR-21和miR-联合预测肾移植术后并发CAN的ROC曲线下面积为0.（95%CI：0.~1.，P＜0.05），当截断值=0.，敏感度为83.3%，特异度为93.8%。详见图3。当联合预测值=0.时，CAN组有83.3%（15/18）的个体被联合预测模型诊断出阳性结果，对照组有93.8%（15/16）的个体被联合预测模型诊断出阴性结果，表明该联合预测模型有较好的诊断价值。

3讨论

年，Banff会议提出了CAN的概念，替代了曾经普遍采用的诊断术语——慢性排斥反应，把CAN定义为一种非特异性的移植肾实质瘢痕化。CAN是一种与多种因素相关并最终导致移植肾失功的慢性进展性疾病，致病原因主要包括免疫因素和非免疫因素，前者包括：急性排斥反应、HLA配型、群体反应性抗体和免疫抑制剂；后者包括：供者年龄、供肾缺血再灌注损伤、受者高血压或高脂血症、感染及CNI相关肾毒性等，涉及的主要病理生理机制包括纤维内膜增厚、慢性移植肾肾小球病变、间质纤维化和肾小管萎缩等。近年来随着新型免疫抑制剂的应用，移植肾存活率有了显著提高，但CAN仍是导致肾移植术后1年内移植肾失功的主要原因。研究表明肾移植术后1年内轻度CAN（Banff分级为Ⅰ级）发生率达94.2%。目前，CAN的诊断主要依据血清肌酐和eGFR等指标以及移植肾穿刺病理活检，但这些方法对肾功能的微小变化不够敏感，或具有侵入性，难以及时发现早期移植肾损伤。因此，研究人员一直致力于探索无创、有效且便于检测的CAN相关生物标志物。

外泌体是一种由细胞分泌并广泛存在于血液、尿液和唾液等体液中的微小囊泡。研究发现，外泌体中含有大量与其来源和功能密切相关的蛋白质、脂质及miRNA等分子，携带大量细胞内生物信息。由于外泌体具有完整膜性结构，外部环境对其干扰小，其内部携带的小分子具有良好稳定性，使其在疾病诊断方面具有独特的优越性。年，Scian等报道了肾移植术后9个月后，发生与未发生CAN的肾移植受者尿液和移植肾穿刺活检样本中存在多种miRNA（miR-32、miR-、miR--3p、miR-和miR-）的差异化表达。Maluf等研究表明，肾移植受者尿液样本中miR-b、miR-b、miR-、miR-和miR--5p可作为监测移植肾功能变化的潜在生物标志物。上述研究提示，肾移植受者外泌体中miRNA与术后并发CAN密切相关，部分miRNA有望成为CAN非侵入性诊断生物标志物。

目前，已有文献报道不同类型体液来源的外泌体miR-21表达变化及其与肾脏疾病间的关系。Saejong等报道，血浆外泌体高水平miR-21预示着更严重的间质纤维化和肾小管萎缩，可作为肾移植术后移植物失功的非侵入性生物标志物。Pan等研究表明，血浆外泌体miR-21可通过作用于肾小管上皮细胞内细胞程序性死亡基因4/核因子κB和PTEN/蛋白激酶B信号通路，发挥抗炎和抗凋亡作用，减轻败血症诱导的肾功能损伤。此外，有研究发现慢性肾病、肾小球损伤、肾纤维化和糖尿病肾病患者尿液外泌体miR-21水平均显著升高。对于外泌体miR-和miR-，尚未见其与肾移植相关的研究报道。有报道提示血清外泌体miR-与肾癌发生相关，而miR-与细胞抗氧化应激功能密切相关。

血浆外泌体多来自于与血管腔接触的细胞（包括各种类型的血细胞和内皮细胞）；尿液外泌体多来自于与肾小管腔接触的细胞（如肾小管上皮细胞）。本研究选取血浆外泌体作为研究对象，主要基于血浆和尿液外泌体含量差异考虑。Cheng等对尿液外泌体miRNA进行深度测序后发现，其种类和丰度都明显低于血浆外泌体。有报道表明，从2.5mL尿液中仅检测到12个高丰度的miRNA表达，而在1mL血浆中可包含多个高丰度表达的miRNA，这可能与膀胱中核糖核酸酶活性较高有关。在外泌体的精确定量方面，血浆外泌体可以采用样品体积及miRNA内参进行定量，而尿液中外泌体囊泡的含量受人体水分摄入的多少影响较大；在样本的易获得性方面，晨尿和其他时间尿液的成分差别较大，且晨尿获取存在一定不便。

本研究结合既往研究结果和miRNA在肾脏和外周血表达水平变化的相关文献报道，探究miR-、miR-21和miR-对肾移植术后并发CAN的诊断价值，研究结果表明，miR-，miR-21和miR-在CAN肾移植受者中均显著上调。进一步建立了血浆外泌体miR-、miR-21和miR-的联合诊断模型，其联合预测肾移植术后并发CAN的诊断效能较好。

综上所述，肾移植受者血浆外泌体富含miR-，miR-21和miR-，且3种miRNA联合诊断肾移植术后并发CAN的诊断效能较高。后续需加大样本量的收集，进一步探讨该血浆外泌体miRNA组合与CAN的疾病进展及预后的相关性，为CAN临床早期诊断及预后提供参考依据。

参考文献（略）